بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش

دسته: داروسازی
بازدید: 110 بار
فرمت فایل: doc
حجم فایل: 1217 کیلوبایت
تعداد صفحات فایل: 94

كلمه اوپیویید برای همه مشتقات طبیعی و نیمه صناعی آلكالوییدی تریاك، داروهای مشابه صناعی و شبه اوپیوییدی كه فعالیت آنها با آنتاگونیست اوپیوییدی، نالوكسان مهار می شود و همچنین چندین پپتید درون زاد كه با چندین زیر گونه از گیرنده های اوپیویید تعامل می كنند، استفاده می شود

قیمت فایل فقط 10,900 تومان

بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                                صفحه

بخش اول: مقدمه

مقدمه.....................................................................................................................

1-1- اوپیوییدها....................................................................................................

1-1-1- تاریخچه..................................................................................................

1-1-2- آلکالوییدهای تریاک.................................................................................

1-1-3- پپتیدهای اوپیویید درون زاد...................................................................

1-1-4- آثار اوپیوییدها بر اعضای مختلف..........................................................

1-1-5- مصارف بالینی اوپیوییدها.......................................................................

1-2- متابولیسم....................................................................................................

1-2-1- تاریخچه..................................................................................................

1-2-2- کلیات متابولیسم......................................................................................

1-2-3- مکان های متابولیسم داروها..................................................................

1-2-4- عوامل تعیین کننده سرعت تغییر شکل زیستی........................................

1-2-5- تکنیک های تجربی بررسی متابولیسم.....................................................

1-2-6- کاربرد و اهمیت بررسی متابولیسم........................................................

1-3- جداسازی سلولهای کبد...............................................................................

1-4- روش های مطالعه شده برای شناسایی و اندازه گیری نوسکاپین و متابولیت هایش 

1-5- کلیاتی درباره کروماتوگرافی و HPLC......................................................

1-5-1- تاریخچه..................................................................................................

1-5-2- اساس کروماتوگرافی..............................................................................

1-5-3- فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع...................................

1-5-4- کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا...........................................................

1-5-5- اساس دستگاه HPLC...........................................................................

عنوان                                                                                                                صفحه

1-6- نوسکاپین.....................................................................................................

1-6-1- برخی اثرات نوسکاپین............................................................................

1-6-2- فارماكوكینتیك نوسكاپین........................................................................

1-6-3- مروری بر روند متابولیسم نوسکاپین....................................................

بخش دوم: روشها و مواد

2-1- اهداف مطالعه..............................................................................................

2-2- دستگاه ها و وسایل ...................................................................................

2-3- مواد.............................................................................................................

2-4- تهیه بافرهای پرفیوژن.................................................................................

2-4-1- محلول Stock بافر هنکس با غلظت 10 برابر.........................................

2-4-2- محلول Stock بافر کربس- هنزلیت با غلظت 2 برابر............................

2-4-3- بافر هنکس یک........................................................................................

2-4-4- بافر هنکس دو.........................................................................................

2-4-5- بافر کربس آلبومین.................................................................................

2-4-6- بافر کربس- هپس...................................................................................

2-5- تهیه محلول کلاژن و کوت کردن پلیت 6خانه..............................................

2-6- محیط کشت.................................................................................................

2-6-1- مراحل تهیه محیط کشت: (1:1) DMEM, F₁₂......................................

2-7- سرم جنین گاو (FBS)...............................................................................

2-8- کیت استریل پرفیوژن..................................................................................

2-9- تهیه هپاتوسیت های تازه.............................................................................

2-9-1- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش.......................................

2-9-2- بررسی حیات سلولی و نحوه اثر دادن دارو روی سلولهای جدا شده از کبد موش        

2-9-3- تهیه نمونه برای انجام آنالیز...................................................................

2-10- روش سنتز مکونین (6 و 7- دی متوکسی فتالید).....................................

2-11- دلایل انتخاب HPLC................................................................................

عنوان                                                                                                                صفحه

2-11-1- مشخصات دستگاه HPLC..................................................................

2-11-2- انواع روش های HPLC آزمایش شده................................................

2-11-3- روش تهیه بافر 10X استات با 4 pH=...............................................

2-11-4- روش تهیه بافر فسفات سدیم Mm 25 با 5/4 pH=...........................

2-12- استخراج متابولیت از ادرار انسان............................................................

بخش سوم: نتایج

3-1- جداسازی سلولهای کبد...............................................................................

3-2- سنتز مکونین...............................................................................................

3-3- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC).........................................

بخش چهارم: بحث و نتیجه گیری

4-1- جداسازی سلول های کبد موش..................................................................

4-2- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC).........................................

4-3- متابولیسم نوسکاپین....................................................................................

4-4- متابولیسم نوسکاپین در ادرار انسان..........................................................

خلاصه انگلیسی.....................................................................................................

منابع......................................................................................................................

اختصارات.............................................................................................................

اختصارات

- ACEI_S: Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors

- BSA: Bovine Serum Albomin

-DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium

- DMSO: Dimethyl sulfoxide

EXP: Exposure

EXT: Extract

FBS: Fetal Bovine Serum

FCS: Fetal Calf Serum

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

MTT: 3- [4, 5- Dimethylthiazol- 2- yl]- 2,5- diphenyl tetrazolium bromide

ml: milliLiter

mM: millimole

: ug: Microgram

: Microlitre

R_t = Retention time

SPE= Solid Phase Extraction

v = volume

w =

مقدمه:

متابولیسم یكی از مراحل مهم فاركوكینتیك داروها است. مطالعه در مورد متابولیسم داروها برای دستیابی به اطلاعاتی در مورد سمیت داروها و مكانیسم اثر آنها مفید است. روش های مختلفی برای بررسی متابولیسم وجود دارند كه عبارتند از: خوراندن تركیبات به حیوانات در حالت عادی یا با كانول در راههای صفراوی و مطالعه و جستجوی متابولیت های دارو در مایعات بیولوژیك مانند خون، ادرار، و ... ، مطالعات آنزیمی بر روی برشهای بافتی، هموژنه ها و اجزای سلولی. مطالعه روی حیوان دارای مشكلاتی است بنابراین در این مطالعه از سوسپانسیون سلولهای جدا شده كبدی استفاده شده است. این روش علاوه بر بررسی متابولیسم در سایر مطالعات بیوشیمیایی از جمله مطالعه روی گلوكونئوژنز، گلیكولیز، سنتز پروتئین، لیپید، اسیدهای چرب و اوره، انتقالات غشاء و ... نیز می تواند مورد استفاده قرار گیرد.

1-1- اوپیوییدها

1-1-1- تاریخچه

كلمه اوپیویید برای همه مشتقات طبیعی و نیمه صناعی آلكالوییدی تریاك، داروهای مشابه صناعی و شبه اوپیوییدی كه فعالیت آنها با آنتاگونیست اوپیوییدی، نالوكسان مهار می شود و همچنین چندین پپتید درون زاد كه با چندین زیر گونه از گیرنده های اوپیویید تعامل می كنند، استفاده می شود.

این مواد سالهاست به عنوان ضددرد، نشاط آور و ضد اسهال كاربرد دارند. اوپیوییدها از تریاك استخراج می شوند. تریاك ترشحات خشك شده كپسول نارس گیاه خشخاش با نام علمی Papaver somniferum است و آلكالوییدهای زیادی دارد كه مسئول اثرات فارماكولوژیك آن هستند. مورفین یكی از آنها است. شواهدی در دست است كه از حدود 6000 سال قبل در مصر باستان، یونان و روم قدیم از گیاه خشخاش استفاده شده است. این گیاه دارای دو محصول اصلی است، دانه های خشخاش كه بدون مورفین و دارای روغن قابل مصرف اندو دیگری تریاك كه دارای شهرت خطرناك و رعب آور است. دانه های خشخاش بعد از رسیدن دارای هیچ ماده خطرناكی نیستند و قابل خوردن یا مصارف دیگر هستند (1و2).

در سال 1803 داروشناس آلمانی سرتورنور (Serturner) با جدا ساختن یك ماده قلیایی فعال خالص از تریاك، فارماكولوژی مدرن این داروها را پایه گذاری نمود. در تاریخ داروسازی، این اولین باری بود كه از یك ماده طبیعی مشتقی با قدرت اثر استاندارد جدا می شد. سرتورنور با الهام از نام الهه رویاهای یونانی Morpheus نام مورفین را به این تركیب جدید داد. استخراج صنعتی مورفین برای اولین بار در سال 1928 با دستگاههایی كه توسط فردی به نام جانوس كابای Janos kabay تكامل یافته بود، عمل شد (2و3).

1-1-2- آلكالوییدهای تریاك

بیش از 40 آلكالویید مختلف از تریاك و عصاره آن به دست آمده است. بعضی از این آلكالوییدها تركیبات تغییر یافته آلكالوییدهای اصلی كه به طور طبیعی در گیاه موجودند، می باشد. آلكالوییدهای اصلی تریاك دو دسته اند:

الف) فنانترن ها: مورفین (%21-%4)، كدئین (%5/2-%8/0)، تبائین (%2-%5/0)

ب) بنزیل ایزوكینولین ها: نوسكاپین (%8-%4)، پاپاورین (%5/2-%5/0)، نارسئین (%2-%1/0) (شکل 1-1).

تریاك همچنین محتوی 3 تا 5 درصد اسیدمكونیك است كه به حال آزاد یا تركیب با مورفین، كدئین یا سایر آلكالوییدها دیده می شود. اسیدمكونیك به صورت منشور كریستالیزه شده در آب و الكل محلول است و با كلرور فریك تولید رنگ قرمز می كند. این رنگ در اثر افزودن اسید كلریدریك تغییر نمی كند. از آنجا كه اسیدمكونیك فقط در تریاك وجود دارد، می توان از این آزمایش جهت تجسس تریاك استفاده نمود (2).

شكل 1- آلكالوییدهای اصلی تریاك (2و4)

1-1-3- پپتیدهای اوپیویید درون زاد

آلكالوییدهای اوپیوییدی (مانند مورفین)، بی دردی را از طریق تأثیر بر مناطقی از مغز كه دارای پپتیدهایی با ویژگی های فارماكولوژیك شبه اوپیویید هستند، تولید می كنند.

عبارتی كه در حال حاضر برای این مواد درون زاد به كار می رود پپتیدهای اوپیویید درون زاد (Endogenous Opioids) است. سه خانواده از پپتیدهای شبه تریاك درون زاد عبارتند از: آندروفین ها، داینورفین ها، انكفالین ها. آلكالوییدهای اوپیوییدی از طریق تأثیر بر گیرنده های این پپتیدهای درون زاد اثرات خود را اعمال می كنند.

جدول 1-1- گیرنده های اوپیوییدی (1)

زیر گونه گیرنده	اعمال	میل تركیبی پپتیدهای اوپیویید درون زاد
مو	بی حسی فوق نخاعی، آرامبخشی، مهار تنفس، كند شدن عبور GI، تغییر آزادسازی هورمون و ناقل عصبی	دانیورفین ها<انكفالین ها<آندروفین ها
دلتا	بی حسی نخاعی و فوق نخاعی، تغییر آزادسازی هورمون و ناقل عصبی	آندروفین و داینورفین ها<<انكفالین ها
كاپا	بی حسی فوق نخاعی و نخاعی، آثار سایكوتومیمتیك، كند شدن عبور GI	آندروفین و انكفالین ها<< داینورفین ها

1-1-4- آثار اوپیوییدها بر اعضای مختلف

1)     بی دردی: اوپیوییدها قوی ترین داروهای موجود برای تسكین درد هستند.
آلگونیست های قوی (یعنی آنهایی كه بالاترین میزان تأثیر ضد دردی را دارند) عبارتند از مورفین، متادون، مپردین و فنتانیل. كدئین، هیدروكدون و اكسی كدون آگونیست های ضعیف تا متوسط هستند. پروپوكسی فن یك داروی آگونیست بسیار ضعیف است.

2)     آرام بخشی و سرخوشی: این اثرات مركزی ممكن است در دوزهای پایین كه برای حداكثر بی دردی لازمند، رخ دهند. بعضی از بیماران دچار خماری (dysphoria)
می شوند. در دوزهای بالاتر، این داروها ممكن است سبب تیرگی شعور شده و اثرات تخدیری (narcosis) داشته باشند.

3)     تضعیف تنفسی: اعمال اوپیوییدها در مدولا سبب مهار مركز تنفسی می شود كه با كاهش پاسخ دهی به تغییرات دی اكسیدكربن همراه است. افزایش PCO₂ ممكن است سبب اتساع عروق مغزی، افزایش جریان خون مغز و افزایش فشار داخل جمجمه شود.

4)     اعمال ضدسرفه ای: سركوب رفلكس سرفه با مكانیسم های ناشناخته، اساس استفاده بالینی اوپیوییدها به عنوان ضدسرفه است.

5)     تهوع و استفراغ: تهوع و استفراغ بر اثر فعال شدن مركز شیمیایی استفراغ (CTZ) ایجاد می شود و با حركت افزایش می یابد.

6)     اثرات معده ای روده ای: این داروها از طریق كاهش پریستالتیزم روده ای موجب یبوست می شوند كه به خاطر تأثیر روی گیرنده های اوپیویید در سیستم عصبی روده است. این عمل قوی اساس استفاده از این داروها به عنوان عوامل ضد اسهال است.

7)     عضلات صاف: اوپیوییدها موجب انقباض عضله صاف مجاری صفراوی می شوند (كه می تواند تولید كولیك صفراوی كند)، تونوس اسفنگستر میزراه و مثانه را افزایش دهند، و كاهش در تونوس رحم ایجاد می كنند كه ممكن است سبب طولانی شدن زایمان شود.

8)     تنگی مردمك (میوزیس): انقباض مردمك اثر مشخصه همه اوپیوییدهاست به جز مپریدین كه تأثیر مهار كننده موسكارینی دارد.

1-1-5- مصارف بالینی اوپیوییدها

1)     بی دردی: این داروها برای درمان درد نسبتا" متوسط تا شدید به كار می روند. در شرایط حاد، آگونیست های قوی معمولا" به صورت تزریقی تجویز می شوند. بی دردی طولانی مدت كه عوارض جانبی آن قدری كمتر است، می تواند با تزریق اپی دورال بعضی از داروهای آگونیستی قوی (مثل مورفین) حاصل شود. فنتانیل از راه پوستی برای تأثیر ضددرد استفاده شده است. برای درد با شدت متوسط و در شرایط مزمن آگونیست های متوسط از راه خوراكی تجویز می شوند.

2)     سركوب سرفه: ضددردهای اوپیوییدی از جمله موثرترین داروهای موجود ضدسرفه محسوب می شوند. این اثر با دوزهای كمتر از حد لازم برای ایجاد بی دردی حاصل
می شود. گیرنده هایی كه در اثر ضدسرفه اوپیوییدها دخالت دارند ظاهرا" با گیرنده های مسئول اعمال دیگر اوپیوییدها متفاوتند. برای مثال، اثر ضدسرفه توسط ایزومرهای دیگر اوپیوییدها كه خاصیت ضددرد و اعتیادآوری ندارند، هم ایجاد می شود. مكانیسم فیزیولوژیك سرفه پیچیده است و اطلاعات كمی از چگونگی اثر اوپیوییدها در تسكین سرفه وجود دارد. به نظر می رسد آثار مركزی و محیطی این داروها، هردو در تسكین سرفه سهیم باشند. روشاول ترین اوپیوییدها در تسكین سرفه، دكسترومتورفان، كدئین، لووپروپوكسی فن و نوسكاپین می باشند. كلیه این داروها (به استثنای كدئین) تا حد زیادی فاقد عوارض جانبی اوپیوییدها می باشند.

3)     درمان اسهال: اوپیوییدهای انتخابی ضد اسهال شامل دیفنوكسیلات و لوپرامید هستند. آنها به صورت خوراكی مصرف می شوند.

4)     درمان ادم حاد ریوی: مورفین به خاطر اثرات همودینامیك آن در ادم پولمونر حاد مفید است. تأثیر آرامبخش آن نیز احتمالا" در تسكین نشانه های ریوی نقش دارد. در این مورد به صورت تزریقی مصرف می شوند.

5)     وابستگی اوپیوییدها: متادون در درمان حالات قطع مصرف اوپیویید و در برنامه های نگهدارنده برای معتادین به كار می رود (1).

1-2- متابولیسم

1-2-1- تاریخچه

احتمالا" اولین مشاهده از متابولیسم تركیبات خارجی توسط گنلین (Gnelin) انجام شده است. وی متوجه شد كه احشا حیواناتی كه با تلور (Tellurium) مسموم شده اند بوی شبیه به بوی سیر می دهد. در سال 1855 وهلر (Wohler) نشان داد كه این بو ناشی از مشتق متیله یعنی دی متیل تلورید می باشد.

اولین مكانیسم كنژوگه شناخته شده، بیوسنتز اسید هیپوریك می باشد كه توسط كلر (Keller) در سال 1842 بعد از مباحثات زیاد از پیشتاز اولیه آن كه اسید بنزوئیك است گزارش گردید. از آن پس مطالعه متابولیسم تركیبات خارجی با پیشرفت شیمی آلی رشد كرد و همچنانكه تركیبات جدیدی سنتز می شوند سمیت و سرنوشت آنها در بدن مورد مطالعه قرار می گیرد. اكسیداسیون بیولوژیك بنزن به فنل و تولوئن به بنزوئیك اسید توسط شولزن و نونین (schultzen , Naunyn) در سال 1867 نشان داده شده است و این امر سپس با نشان دادن وجود كنژوگاسیون اتری سولفات (باومان 1876 Baumann)، كنژوگاسیون گلوكورونید (شمیدبرگ schmiededberg و میر meyer سال 1879) و سنتز اسید مركاپتوریك (جافه Jaffe و باومان Baumann و پروسه Preuse مستقلا" در سال 1879) تعقیب شد. این راههای مختلف متابولیكی در ابتدا منحصرا" واكنش بیوشیمیایی تركیبات خارجی تلقی می شد تا اینكه سرانجام در حدود اوایل قرن بیستم اهمیت آنها در كاهش سمیت این تركیبات مورد قدردانی قرار گرفت.

واكنش های مختلف متابولیك به تدریج یكی بعد از دیگری كشف گردیدند مثلا" تبدیل سیانور به تیوسیانات (لنگ 1894 Lang)، احیای تركیبات نیتروحلقوی (میر 1905) و كنژوگاسیون اسید فنیل استیك با گلوتامین (Theirfelder and shermin 1914) .

ولی به هر حال شاید مهم ترین این پیشرفت های جدید كشف Brodie و همكارانش بود كه آنزیمهایی كه بسیاری از تغییرات متابولیك را انجام می دهند در رتیكولوم اندوپلاسمیك (میكروزوم) سلول كبدی نشان دادند. این امر سبب درك عمیق تری از مكانیسم واكنش های غیرسمی شدن گردید و سرانجام منجربه این نتیجه گردید كه این واكنش ها روندهای اختصاصی برای حذف تركیبات خارجی از بدن هستند و ربطی به متابولسیم سوبستراهای معمولی ندارند (5).

1-2-2- كلیات متابولیسم

انسانها روازنه در معرض تعداد گسترده ای از مواد بیگانه هستند كه اصطلاحا" xenobiotics نامیده می شوند. موادی كه از طریق شش ها یا پوست جذب بدن می شوند یا خیلی عمومی تر به صورت غیرعمدی و به شكل مواد موجود در غذاها یا نوشیدنی ها یا عمدا" به شكل دارو به منظور اهداف درمانی یا تفریح و خوشگذرانی به كار می روند. قرار گرفتن در معرض xenobiotic های محیطی می تواند ناخواسته یا تصادفی باشد و در صورتیكه این تركیبات در هوا، آب و غذا موجود باشند كاملا" اجتناب ناپذیرند (1). گیاهان و حیواناتی كه به عنوان منابع غذایی توسط انسان مورد استفاده قرار می گیرند مملو از تركیبات شیمیائی گوناگون هستند. زندگی امروزی انسان باعث رشد و پیدایش اقلام یكبار مصرفی می شوند كه سبب آلودگی محیط می شوند. پیشرفت در صنعت اغلب با رشد و زایش مواد جدید شیمیایی همراه است. رشد و پذیرش صنعت داروسازی استفاده عمومی از داروهای درمانی و سایر xenobiotic ها را عرضه كرده است (6).

همزمان با تكامل سلولهای یوكاریوت و تكامل تنوع گونه ای و تیره ای ارگانیسم ها مكانیسم هایی برای مقابله با تاخت و تاز مواد شیمیائی گوناگون ذكر شده در پاراگراف بالا به وجود آمده است (6).

مسلما" دفع كلیوی در پایان فعالیت بیولوژیكی تعدادی از داروها خصوصا" آن عده ای كه صاحب حجم مولكولی كوچك و یا ویژگی قطبی بالا هستند (به دلیل وجود گروههای عاملی كه در pH فیزیولوژیك یونیزه اند) نقش محوری را بازی می كند. اما بسیاری از داروها چنین ویژگی فیزیكوشیمیایی را نشان نمی دهند و در pH فیزیولوژیك بدن تمایل دارند كه به شكل غیریونیزه و لیپوفیل باقی بمانند و اغلب دارای اتصال بالا به پروتئین های پلاسما هستند. چنین موادی كه به آسانی از گلومرول ها فیلتره نمی شوند. از سوی دیگر طبیعت لیپوفیل غشاء توبول های كلیوی جذب مجدد تركیبات هیدروفوب را تسهیل می كند. بنابراین بسیاری از داروها می بایست طول اثر طولانی می داشتند اگر پایان اثر آنها تنها از طریق دفع كلیوی صورت می گرفت (1).

تركیبات xenobiotic كه برای فیلتره شدن به وسیله كلیه بیش از حد لیپوفیل هستند مستقیما" توسط بدن متابولیزه می شدند تا تركیباتی با قطبیت بالاتر به وجود آورند كه قابلیت دفع از طریق كلیه را داشته باشد (7). محصولات متابولیكی، اغلب فعالیت فارماكودینامیكی كمتری نسبت به والدین خود دارند و یا فاقد فعالیت هستند. با این وجود تعدادی از محصولات سوخت و ساز داروها (Biotransformation) ارائه كننده فعالیت بیشتر و یا خصوصیات سمی همچون سمیت سلولی (cytoxicity)، جهش زایی (Mutagenicity)، خاصیت ناقص كننده جنین (Teratogenicity) و سرطان زایی (carcinogenicity) می باشند (1).

جهت دریافت فایل بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش لطفا آن را خریداری نمایید

قیمت فایل فقط 10,900 تومان

برچسب ها : بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش , طرح توجیهی بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش , دانلود بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش , داروی نوسکاپین , آثار اوپیوییدها بر اعضای مختلف , مصارف بالینی اوپیوییدها , محیط کشت , سنتز مکونین , روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC) , جداسازی سلولهای کبد , کی